細(xì)菌不但個體微小，其基因組也比動植物小得多，一般在10M以內(nèi)。微生物基因組測序能夠檢測微生物全基因組的核苷酸變異，通過全基因組測序，研究人員可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)、拷貝數(shù)變異(CNV)、插入缺失(InDel)、結(jié)構(gòu)變異(SV)等變異信息，應(yīng)用范圍涉及臨床醫(yī)藥研究、微生物致病性研究、物種進(jìn)化分析等領(lǐng)域。
1、實驗方案
測序策略：Illumina MiSeq PE250/PE300
數(shù)據(jù)量：推薦測100×以上
2、數(shù)據(jù)分析
2.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評估
（2）K-mer分析以及基因組大小估計
（3）序列組裝
（4）組裝基因組的深度和覆蓋度分析
（5）組裝結(jié)果的核酸庫比對分析
（6）基因預(yù)測
（7）基因功能注釋(GO-COG/KOG)
（8）基因生物通路注釋(KEGG)
2.2 高級信息分析
（1）基因組詳細(xì)信息環(huán)形圖
（2）共線性分析
（3）基因家族分析
（4）CRISPR預(yù)測
（5）基因島預(yù)測（毒力島）
（6）前噬菌體預(yù)測
（7）分泌蛋白預(yù)測
（8）動植物病原菌致病性分析等
3、技術(shù)流程
4、案例分析
案例（1）高通量測序分析發(fā)現(xiàn)新細(xì)菌
德國微生物學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)研究所微生物系最近從咸水環(huán)境微生物墊的低氧過渡區(qū)中分離培養(yǎng)獲得了一種中度嗜鹽，專性厭氧，分解糖類的細(xì)菌，并編碼代號為L12-Fru-ABT。利用16s測序分析后發(fā)現(xiàn)該微生物應(yīng)該代表著一個新的種屬，研究發(fā)現(xiàn)該菌在各種缺/微氧環(huán)境中都廣泛存在，比如咸水環(huán)境，沸水和動物腸道；隨后，研究人員利用全基因組測序方法對該菌進(jìn)行基因組序列分析，結(jié)合該菌的表型，推斷出L12-Fru-ABT該菌及其相關(guān)細(xì)菌是能夠?qū)ｉT適應(yīng)和利用微生物墊或生物膜產(chǎn)生的硫酸化的甘油聚合物。
圖1 基于16s rRNA基因測序的L21-Fru-ABT在發(fā)育樹的位置圖
圖2 K.glycovorans L21-Fru-ABT和幾個PVC superphylum的代表性細(xì)菌的基因組系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)成成分
案例（2）耐鹽耐堿性的克雷伯氏菌.D5A全基因組分析
中國科學(xué)院南京土壤研究所研究人員利用Hiseq2000測序平臺，采用Pair-end測序和mate pair測序的技術(shù)對克雷伯氏菌.D5A種屬進(jìn)行了全基因組測序，并對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了系統(tǒng)性分析。研究其有利于促進(jìn)植物生長的相關(guān)基因，尤其是與耐鹽耐堿等相關(guān)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌.D5A種屬的基因組共為5,540,009bp，GC含量占57.15%，同時注釋了一些基因比如3-吲哚乙酸（IAA）合成基因，溶磷作用基因，含體細(xì)胞生成基因，羥基丁酮和2,3-丁二醇合成基因，還有固氮功能基因等。
圖1 Klebsiella sp. D5A種屬代謝通路和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)一覽圖
參考文獻(xiàn)
[1] Spring et al. Characterization of the first cultured representative of Verrucomicrobia subdivision 5 indicates the proposal of a novel phylum. The ISME Journal, 2016.
[2] Liu et al. Whole genome analysis of halotolerant and alkalotolerant plant growth-promoting rhizobacterium Klebsiella sp. D5A. Scientific Reports, 2016.
