RNA Immunoprecipitation (RIP) 是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能更有效地發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。RIP-seq技術(shù)使用特異性抗體對(duì)RNA結(jié)合蛋白或者特殊修飾的RNA進(jìn)行免疫共沉淀后，分離純化RNA，通過(guò)高通量測(cè)序和分析，深度解析與目標(biāo)蛋白相互結(jié)合的RNA的區(qū)域或種類。
應(yīng)用方向
(1)驗(yàn)證RNA與靶蛋白的相互作用
(2)在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)鑒定RNA與RBP的相互作用網(wǎng)絡(luò)
(3)分析RBP與miRNA、lncRNA等非編碼RNA的相互作用
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）全轉(zhuǎn)錄組覆蓋：與RIP芯片相比，可在全轉(zhuǎn)錄組范圍對(duì)蛋白結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行篩選與鑒定；
（2）高靈敏度：每個(gè)樣本可獲得數(shù)百萬(wàn)條的序列標(biāo)簽，可發(fā)現(xiàn)研究轉(zhuǎn)錄組上稀有的蛋白結(jié)合位點(diǎn)；
（3）高精確率：可獲得高水平的信噪比數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確區(qū)分真實(shí)事件與噪音，精確定位蛋白結(jié)合位點(diǎn)；
（4）重復(fù)性好：深度測(cè)序保證了檢測(cè)隨機(jī)性，可不需技術(shù)重復(fù)。
生信分析流程
標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）將reads比對(duì)到基因組：將預(yù)處理reads與reference genome進(jìn)行mapping，最后得到mapping的sam結(jié)果文件，給出mapping結(jié)果統(tǒng)計(jì)；
（2）peak detect：應(yīng)用sam文件進(jìn)行peak富集區(qū)查找；
（3）motif detect：查找結(jié)合位點(diǎn)區(qū)結(jié)構(gòu)特性，尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域的motif結(jié)構(gòu)；
（4）基因關(guān)聯(lián)：應(yīng)用結(jié)合位點(diǎn)區(qū)位置，確定其周圍所涉及的基因；
（5）關(guān)聯(lián)基因GO差異分析：以參考基因組為背景集對(duì)結(jié)合位點(diǎn)關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行GO富集分析。
技術(shù)流程
樣本要求
RIP捕獲的RNA>500ng，濃度>30ng/μL，OD260/280為1.8-2.0，OD260/230為1.5-1.8。
項(xiàng)目周期
標(biāo)準(zhǔn)流程完成時(shí)間為50個(gè)工作日。
案例分析
案例（1）Rocaglates把DEAD-box蛋白eIF4A運(yùn)輸?shù)叫蛄羞x擇性翻譯抑制物
Rocaglamide A（RocA）代表一類能夠選擇性殺傷非整倍體腫瘤細(xì)胞和抑制特殊mRNA翻譯的蛋白合成抑制劑。RocA作用于真核起始因子4A(eIF4A)，一種ATP依賴性的DEAD-box RNA解旋酶；它的mRNA選擇性是作用于高度結(jié)構(gòu)化的5’非翻譯區(qū)，這一過(guò)程高度依賴于eIF4A-調(diào)節(jié)的解旋反應(yīng)。然而，美國(guó)加州大學(xué)分子與細(xì)胞生物學(xué)系研究人員利用Rip-seq技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)：Rocaglate（藥物）治療也許并不能從表現(xiàn)形式上復(fù)制eIF4A活性的缺失導(dǎo)致的缺陷，因?yàn)檫@藥物實(shí)際上只是增加了eIF4A和RNA的親和力。特別說(shuō)明的是5’非翻譯區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于RocA選擇性而言只是一個(gè)次要的決定因素，同時(shí)該RocA不會(huì)通過(guò)降低eIF4A有效性來(lái)抑制翻譯。相反，在體外和細(xì)胞中，RocA以ATP非依賴性的方式特異性地將eIF4A夾送到polypurine序列中。本研究通過(guò)這個(gè)重要的抗癌化合物來(lái)闡明了選擇性翻譯抑制的重要機(jī)理。
圖1 由RocA選擇性翻譯抑制導(dǎo)致的作用于eIF4A的RNA序列選擇性改變
參考文獻(xiàn)
[1] Iwasaki et al. Rocaglates convert DEAD-box protein eIF4A into a sequence-selective translational repressor. Nature, 2016.
