Exosome作為活細(xì)胞分泌的含有RNA和蛋白質(zhì)的微囊，大小為30-100nm，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多種體液中。最新研究表明，體液中 exosomal RNA （特別是miRNA、piRNA和lncRNA等非編碼RNA）在不同的疾病模型中存在明顯的表達(dá)差異。同時(shí)，這些分子被exosomes的脂膜所包裹和保護(hù)，能保持其原有穩(wěn)定性和生物學(xué)功能，有望成為液體活檢的重要分子標(biāo)志物。
通過exosome lncRNA測(cè)序技術(shù)，可以開發(fā)針對(duì)復(fù)雜疾病的無創(chuàng)早期檢測(cè)標(biāo)志物；指導(dǎo)針對(duì)復(fù)雜疾病特別是腫瘤的個(gè)性化治療；用于疾病的預(yù)后判斷，特別是循環(huán)系統(tǒng)疾病和腫瘤。
華銀采用全球領(lǐng)先的exosome RNA富集和提取技術(shù)，并結(jié)合微量RNA建庫(kù)和高通量測(cè)序技術(shù)，提供exosome lncRNA研究整體解決方案，為廣大的生物醫(yī)學(xué)研究者提供最高質(zhì)量的技術(shù)服務(wù)。
1、實(shí)驗(yàn)方案
測(cè)序策略：Illumina 平臺(tái) PE150
數(shù)據(jù)量：12G clean data
2、技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）更佳的提取方法：針對(duì)客戶樣本類型，提供不同的提取方法（超離法或試劑盒法等），提高外泌體質(zhì)量；
（2）更優(yōu)質(zhì)的改良：在提取外泌體之前，免費(fèi)給客戶提供過膜處理的選擇，可進(jìn)一步增加樣本純度（僅限細(xì)胞上清和其他體液）；
（3）更全的鑒定實(shí)驗(yàn)：提供外泌體透射電鏡觀測(cè)、粒徑分析、表面標(biāo)志蛋白檢測(cè)共三項(xiàng)鑒定服務(wù)，滿足MISEV2018指南對(duì)胞外囊泡的鑒定要求；
（4）更領(lǐng)先的建庫(kù)策略：采?獨(dú)有的微量建庫(kù)技術(shù)，極?提高建庫(kù)成功率；
（5）更合適的技術(shù)方案：針對(duì)不同的外泌體ncRNA(miRNA、lncRNA、circRNA)研究熱點(diǎn)，量身打造最優(yōu)解決方案。
3、數(shù)據(jù)分析
3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）數(shù)據(jù)過濾及質(zhì)量評(píng)估
（2）核糖體RNA去除率計(jì)算
（3）比對(duì)參考基因組及統(tǒng)計(jì)
（4）基因表達(dá)水平分析
（5）基因表達(dá)差異及聚類分析
（6）差異基因KEGG生物通路富集分析（僅限于模式物種）
（7）差異基因GO功能富集分析（僅限于模式物種）
（8）已知mRNA表達(dá)量分析
（9）已知mRNA差異表達(dá)及聚類分析
（10）已知lncRNA表達(dá)量分析
（11）已知lncRNA差異表達(dá)及聚類分析
（12）預(yù)測(cè)新lncRNA
（13）新lncRNA鑒定和表達(dá)量分析
（14）新lncRNA差異表達(dá)及聚類分析
（15）新lncRNA家族分析
（16）SNP和Indel檢測(cè)與注釋
（17）生物學(xué)重復(fù)樣品間相關(guān)性分析
（18）蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析
（19）基因融合
（20）主成份分析（PCA）
（21）特征性差異表達(dá)基因分析
（22）lncRNA保守性分析
（23）可變剪切
3.2 高級(jí)分析
（1）已知mRNA-lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
（2）基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化及優(yōu)化基因的表達(dá)值計(jì)算
（3）eQTL分析
4、技術(shù)流程
5、案例分析
案例（1）外泌體傳遞lncARSR以提升腎癌細(xì)胞的舒尼替尼抗藥性
舒尼替尼耐藥是晚期腎細(xì)胞癌（RCC）治療的一個(gè)難點(diǎn)。了解這一耐藥現(xiàn)象的機(jī)制并制定抑制舒尼替尼耐藥的有效策略是目前臨床應(yīng)用中面對(duì)的重要問題。該研究確定了一個(gè)與舒尼替尼抵抗相關(guān)的lncRNA（命名為lncARSR）。在RCC細(xì)胞中，lncARSR通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-34/miR-449來促進(jìn)AXL和c-Met表達(dá)而賦予細(xì)胞舒尼替尼抗性。此外，具有生物活性的lncARSR可以被納入外泌體并被傳輸?shù)绞婺崽婺崦舾行?/span>RCC細(xì)胞，從而傳播舒尼替尼抗性。對(duì)舒尼替尼抗藥性RCC施加舒尼替尼的同時(shí)靶向關(guān)閉lncARAR或同時(shí)施加AXL/c-MET抑制劑可以有效緩解腫瘤細(xì)胞對(duì)舒尼替尼抵抗。因此，lncARSR可用作預(yù)測(cè)和治療舒尼替尼耐藥的潛在治療靶標(biāo)。
圖1 lncARSR RCC舒尼替尼抗性通路的作用機(jī)制
案例（2）前列腺外泌體中lncRNA富含miRNA種子序列
本研究中分析了在幾組前列腺癌的外泌體和其親代細(xì)胞系的lncRNA表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤細(xì)胞系來源外泌體均富含某些lncRNA。這些外泌體lncRNA本身富含miRNA種子序列，包括let-7家族成員以及miR-17，miR-18A，miR-20a，miR-93和miR-106b。并且在外泌體中同時(shí)伴隨高豐度相同種類的miRNA。此外，外泌體lncRNA也含有RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合序列，最常見的兩種基序是ELAVL1和RBMX。鑒于外泌體lncRNA富含miRNA種子序列與RBP部位，其相互作用可能會(huì)在前列腺癌癌變過程中發(fā)揮重要功能。
圖1 前列腺細(xì)胞外泌體中lncRNA的數(shù)量和表達(dá)差異
參考文獻(xiàn)
[1] Qu et al. Exosome-transmitted lncARSR promotes sunitinib resistance in renal cancer by act-ing as a competing endogenous RNA. Cancer Cell, 2016.
[2] Ahadi et al. Long non-coding RNAs harboring miRNA seed regions are enriched in prostate cancer exosomes. Scientific Reports, 2016.
